Проблемы Эволюции |
Дополнение 1 к обзору 28
Специальное дополнение №1 к обзору "Бактерия вольбахия - повелитель мух"
© А.В.Марков, И.А.Захаров-Гезехус, 2004. Настоящая страничка (включая все подразделы) является официальной электронной публикацией. Приведенные в ней оригинальные идеи и факты, к настоящему времени не опубликованные в печатных изданиях, охраняются законами об авторском праве. При цитировании, перепечатке или ином использовании материалов данной публикации ссылка на источник обязательна.
Дата последнего изменения: 11 декабря 2004.
Первые результаты анализа недавно "расшифрованного" генома вольбахии (штамм wMel, живущий в мухах Drosophila melanogaster) изложены в статье: Wu et al., 2004. Phylogenomics of the Reproductive Parasite Wolbachia pipientis wMel: A Streamlined Genome Overrun by Mobile Genetic Elements. Сам геном доступен по адресу: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NC_002978
Геном вольбахии невелик по размеру (у штамма wMel - 1,267,782 пар оснований, 1322 "предсказанных" гена) , что вообще характерно для бактерий - облигатных внутриклеточных паразитов, переложивших значительную часть задач собственного жизнеобеспечения на хозяина. Авторы вышеуказанной статьи многократно подчеркивают, что геном вольбахии сильно упрощен (streamlined).
При этом, однако, в ее геноме обнаружено необычайно большое количество мобильных генетических элементов (МГЭ), в том числе три профага (а у некоторых других штаммов вольбахии обнаружены активные фаги), а также повторяющихся последовательностей. Это - уникальная особенность вольбахии, отличающая ее от всех остальных внутриклеточных бактерий. С точки зрения эволюционной генетики, здесь явный парадокс: с одной стороны, налицо ярко выраженная тенденция к упрощению (ничего лишнего!), с другой - рекордно большое количество МГЭ, которые, казалось бы, в ходе упрощения генома должны были быть элиминированы одними из первых, как вовсе не обязательные для выживания бактерии в ее весьма стабильной среде обитания - цитоплазме клеток хозяина.
Генетический анализ показал, что обнаруженные у вольбахии МГЭ отнюдь не бездействуют. Геном несет следы многочисленных и частых реорганизаций, связанных с перемещениями МГЭ, и с большим распространением повторов, которые могут служить сайтами внутригеномной рекомбинации. Сравнение геномов разных штаммов вольбахии подтверждает это. Еще более веским доказательством постоянно идущих у вольбахии активных перестановок участков генома является сравнение порядка расположения генов в кольцевых хромосомах вольбахии и ее ближайшего родственника - риккетсии. Набор генов у этих бактерий почти одинаков, однако в порядке их расположения в хромосоме не наблюдается практически никакого сходства. Судя по всему, мобильные элементы играли очень важную роль в эволюции вольбахии.
Например, есть данные, согласно которым фаг WO, которым заражены многие штаммы вольбахии, уже давно развивается вместе с ней, часто переносится от штамма к штамму, играет роль в ее эволюции и в общем – полезен ей (Masui et al., 2000).
По сравнению с другими (в том числе близкими) видами у вольбахии очень активно происходят также дупликации генов. Активно дуплицировались МГЭ, многие гены белков с неизвестной функцией, дуплицирован участвующий в репарации mismatch repair gene mutL и др.
Предполагается, что вольбахия “нахватала” мобильные элементы из какого-то внешнего источника (возможно, с помощью фагов) уже после разделения линий вольбахии и риккетсии, но до расхождения штаммов вольбахии (которое произошло примерно 100 млн. лет назад). Этот вывод основан на том, что у риккетсии соответствующие МГЭ отсутствуют, а у разных штаммов вольбахии они сходны между собой. К тому же, по-видимому, МГЭ вольбахии уже успели пройти т.н. "амелиорацию" (частоты использования разных кодонов обычно специфичны для разных организмов; это позволяет идентифицировать гены, недавно полученные путем горизонтального переноса; впоследствии "чужой" ген теряет свои специфические отличия, приобретая "рисунок", свойственный новому хозяину. Это и называется амелиорацией, и говорит о том, что свои МГЭ вольбахия приобрела достаточно давно).
Как же объясняют специалисты парадоксально большое число МГЭ в упрощенном геноме вольбахии? Предполагаемая причина (Wu et al., 2004) – слабое действие стабилизирующего/отсеивающего отбора по сравнению с мутациями и генетическим дрейфом, что обусловлено частыми “бутылочными горлышками” в популяциях вольбахии.
Однако это объяснение представляется нам не вполне удовлетворительным. Если бы и впрямь на вольбахию так слабо действовал стабилизирующий отбор, то ее геном должен был бы быть переполнен не только МГЭ, но и самым разнообразным другим "мусором" – псевдогенами и т.п. Однако этого не наблюдается. Вышеупомянутая "амелиорация" привнесенных МГЭ тоже вряд ли могла бы проходить в условиях такого слабого отбора. Более логичным кажется предположение, что МГЭ для чего-то очень нужны вольбахии, и поэтому сохраняются.
Может быть, они нужны для того, чтобы штаммы вольбахии могли справляться с "эволюционными кризисами", регулярно возникающими в ее "среде обитания" из-за быстрых эволюционных скачков, совершаемых хозяевами – например, дрозофилами, у которых стресс может вызывать активизацию их собственных МГЭ и взрывной мутагенез (см.: В.А. Ратнер. Внешние и внутренние факторы и ограничения молекулярной эволюции. 1993). Для дрозофил также характерно быстрое возникновение репродуктивной изоляции при экологической дивергенции, показанное экспериментально (Dodd, 1989).
Обсуждаемый "парадокс" можно соотнести с данными по мутационному процессу в природных популяциях Drosophila melanogaster (И.К.Захаров, "Мутации и мутационный процесс в природных популяциях Drosophila melanogaster". Дисс. докт. биол. наук. Новосибирск, 1995). У этих мух - хозяев штамма wMel - отмечены вспышки мутагенеза, синхронные на большой территории, причем многие из этих мутаций во время вспышек очень неравномерно распространены между полами (у самок частота мутации бывает в несколько раз выше, чем у самцов). Последнее говорит о возможной связи этих мутаций с передающимися по материнской линии внутриклеточными бактериями. Взрывы мутабильности у D.melanogaster в ряде случаев объясняются повышением активности МГЭ. Могут ли быть аналогичные «взрывы» у вольбахии, обладающей аномально большим числом МГЭ, и может ли быть тут какая-то связь с мутагенезом хозяина?
Хорошо бы, конечно, тщательно проверить, нет ли сходства между МГЭ у дрозофилы и вольбахии? Нет ли следов латерального переноса МГЭ между паразитом и хозяином? Например, мобильный элемент gypsy, вызывающий спонтанные мутации у дрозофилы, обладает свойствами и мобильного элемента и ретровируса, способного заражать через корм особей из чувствительных линий (Kim et al., 1994). Предварительные результаты в этой области, однако, говорят об отсутствии каких бы то ни было следов обмена генетическим материалом между вольбахией и ее хозяином - D.melanogaster.
В полном и подробном обзоре по биологии вольбахии (R. Stouthamer, J. A. J. Breeuwer, and G. D. D. Hurst. WOLBACHIA PIPIENTIS: Microbial Manipulator of Arthropod Reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 1999. 53: 71–102.) основной вывод звучит как вопрос: What is it that gives Wolbachia such amazing plasticity? (Что же обеспечивает вольбахии столь удивительную пластичность?)
В фундаментальной работе по анализу генома вольбахии один из главных выводов тоже можно сформулировать в виде вопроса: почему же у вольбахии так много мобильных элементов и дупликаций?
Вывод напрашивается сам собой. Скорее всего, именно изобилие активных мобильных элементов обеспечивает вольбахии ее необычайную эволюционную пластичность. Необходимость сохранения пластичности, диктуемая жизнью в быстро эволюционирующих хозяевах, а также горизонтальными переходами вольбахии от одних хозяев к другим (часто - неродственным), в свою очередь, обуславливает сохранение МГЭ в геноме, несмотря на его общее упрощение.
Разумеется, все вышесказанное - это лишь общие соображения, относящиеся к механизмам эволюции вольбахии и причинам ее эволюционной пластичности, но ничего не говорящие о тех конкретных механизмах (генах, белках и их комплексах), которые обеспечивают вольбахии контроль над размножением и развитием хозяина. Между тем анализ генома вольбахии позволяет выдвинуть ряд проверяемых гипотез о природе этих механизмов. Вполне очевидны три основные группы генов, являющиеся самыми "перспективными" кандидатами на роль регуляторов взаимоотношений с хозяином. Вот они:
1) Так называемые "поверхностные белки вольбахии", или поверхностные антигены - wsp (Wolbachia surface protein).
2) Белки, входящие в состав "секреторной системы типа IV" (type IV secretion system - T4SS) - устройства, обеспечивающего выведение белковых продуктов (а возможно, и нуклеиновых кислот) из бактерии в цитоплазму хозяина.
3) Белки с анкириновыми повторами (ankyrin repeats) - по своему строению это типичные эукариотические регуляторные белки. У эукариот белки с анкириновыми повторами участвуют в регуляции многих важных процессов, в том числе управляют функционированием цитоскелета.
Рассмотрим по порядку все три группы генов.
Эти белки, располагающиеся на наружной поверхности вольбахии, с самого начала привлекали к себе наибольшее внимание исследователей. Оказалось, что последовательности генов wsp сильно варьируют у разных штаммов. Более того, эти последовательности настолько штаммоспецифичны, что по ним оказалось удобнее всего проводить классификацию разновидностей вольбахии (что сейчас и делается - нуклеотидная последовательность гена wsp является главным систематическим признаком в классификации вольбахий). Белок wsp к тому же является одним из наиболее сильно экспрессируемых, т.е. вольбахия продуцирует очень много молекул этого белка (Braig et al., 1998).
Известно, что поверхностные белки (антигены) бактерий часто играют ключевую роль в их взаимоотношениях с хозяином. Помимо этого общего соображения, об участии wsp в воздействии вольбахии на хозяина говорят следующие факты.
1) Как отмечено в нашем общем обзоре, самая главная манипуляция, совершаемая вольбахией над своими хозяевами (цитоплазматическая несовместимость) включает в себя элемент штаммоспецифического распознавания. Вольбахии, находящиеяся в яйцеклеке, распознают специфическую "метку", оставленную на хромосомах сперматозоида другими вольбахиями, живущими в семенниках самца. Если метка распознается как "своя", т.е. оставленная тем же самым штаммом, сидящие в яйцеклетке вольбахии спасают отцовские хромосомы от разрушения. Таким образом, уже сам факт обнаружения у вольбахии строго штаммоспецифичного белка должен был привлечь внимание. Такой белок может служить как "меткой", так и "распознающим агентом" (и даже, теоретически, тем и другим одновременно).
2) Действительно, уже в первой работе, посвященной выделению и изучению белка wsp (Braig et al., 1998), было показано, что вариации последовательности этого белка коррелируют со способностью определенных штаммов вольбахии вызывать цитоплазматическую несовместимость и "спасать" отцовские хромосомы (This sequence variation correlated with the ability of certain Wolbachia strains to induce or rescue the cytoplasmic incompatibility phenotype in infected insects).
3) Показана также корреляция вариантов wsp со специфической локализацией вольбахий в ооцитах и эмбрионах дрозофилы (“this localization is congruent with the classification of the organisms based on the wsp (Wolbachia surface protein) gene sequence”) (Veneti et al., 2004). В перемещениях вольбахии внутри клеток хозяина и в развивающемся эмбрионе большую роль играет взаимодействие бактерий с цитоскелетом. Вольбахии в яйце связаны с тубулиновыми микротрубочками; они концентрируются у полюсов митотических веретен и т.д.
4) Если белок wsp действительно играет важную роль во взаимодействии вольбахии с хозяином, то его эволюционные изменения должны у паразитических ("вредных") штаммов происходить быстрее, чем у мутуалистических ("полезных"). Дело в том, что в первом случае между паразитом и хозяином должна происходить своего рода "гонка вооружений", а во втором - они стремятся прийти к оптимальному компромиссу и стабилизироваться в этом состоянии к обоюдному удовольствию. Данная гипотеза была проверена и подтверждена биоинформационными методами (Jiggins et al., 2002). Сравнивались "вредные" вольбахии членистоногих с "полезными" вольбахиями нематод.
У штамма wMel в геноме присутствуют три паралогичных "варианта" гена wsp (собственно wsp, известный ранее и использовавшийся для систематики, wspB и wspC), причем они довольно сильно отличаются друг от друга (сходство wspB с wsp – 19.7%, wspC с wsp – 23.5%.). Изучен wspB (его ортологи) у других штаммов вольбахии и показано, что этот ген эволюционирует еще быстрее, чем wsp, и может тоже служить для систематики.
В последовательностях генов wsp вольбахии обнаруживается некоторое сходство с генами белков, регулирующих транспорт различных веществ (например, липопротеинов) из бактериальной клетки во внешнюю среду. Кроме того, нами обнаружено сходство wsp с некоторыми бактериальными белками-агглютининами, участвующими в специфическом связывании определенных протеинов.
Вольбахия обладает сложным молекулярным аппаратом, служащим для вывода различных веществ из бактериальной клетки в цитоплазму хозяина. Называется этот аппарат "секреторная система типа IV" (Type IV secretion system, T4SS) (Masui et al., 2000). Его также называют "адаптированной системой конъюгации", поскольку эта система действительно развилась из аппарата конъюгации (полового процесса) - контролируемого обмена участками ДНК между родственными бактериями.
Конъюгационный аппарат состоит из трех частей: проводящего канала, расположенного в толще клеточной стенки; прикрепленных изнутри АТФ-аз - "моторчиков", обеспечивающих весь аппарат необходимой энергией; торчащего снаружи "пилуса" (множественное число - "пили") - трубочки, при помощи которой конъюгирующие бактерии, собственно, вступают друг с другом в контакт.
Многие патогенные бактерии научились использовать этот аппарат в несколько иных целях. Вместо того, чтобы в ходе полового процесса вводить через канал и пилус свою ДНК в родственную бактерию, они вводят разнообразные вредные вещества в клетки хозяина.
"Адаптированный аппарат конъюгации", или T4SS, лучше всего изучен у бактерии Agrobacterium tumefaciens, вызывающей опухоли у растений. Бактерия эта в высшей степени интересна. Ее называют "природным генным инженером". При помощи T4SS она вводит в клетки растений фрагмент своей ДНК в комплексе с белками. Гены бактерии экспрессируются в растительной клетке, что и приводит к развитию опухоли. Этого "природного генного инженера" и его уникальный аппарат для ввода ДНК в растительные клетки сейчас активно используют "обычные", т.е. не природные, а человеческие генные инженеры в своих экспериментах.
У других бактерий, обладающих T4SS (например, Bordetella pertussis, Helicobacter pylori, Brucella suis, Legionella pneumophila, Rickettsia prowazekii), насколько нам известно, этот аппарат используется для внедрения в цитоплазму хозяина различных белков, но не ДНК. Эти белки играют большую роль в вирулентности и патогенезе. Так, например, суперполиморфная кишечная бактерия Helicobacter pylori выделяет через T4SS в эпителиальные клетки хозяина белок CagA, который затем активируется неизвестным пока белком-киназой хозяина (фосфорилируются остатки тирозина в CagA). Активированный CagA включается в сигнально-регуляторные каскады эукариотической клетки, воздействует на цитоскелет и в конечном счете приводит к активизации образования псевдоподий эпителиальными клетками кишечника (Stein et al., 2000).
Важно отметить, что белки T4SS - отнюдь не только транспортировщики. Не только выводимые с их помощью макромолекулы, но и они сами активно взаимодействуют с хозяином. Так, обнаружены 4 белка растения Arabidopsis, которые специфически взаимодействуют с белком virB2, входящим в состав пилуса T4SS у Agrobacterium tumefaciens. Заражение приводит к увеличению их экспрессии. Трансгенные растения с подавленной экспрессией этих белков отличаются меньшей восприимчивостью к возбудителю (их клетки меньше изменяются под его воздействием, и образование опухолей замедляется или не происходит вовсе). Наоборот, при повышенной экспрессии этих белков растение становится более чувствительным к влиянию агробактериума (Hwang, Gelvin, 2004).
Реконструкция аппарата T4SS агробактериума (из статьи Cao, Saier, 2001.).
OM - наружная мембрана (у вольбахии собственная наружная мембрана редуцирована, вместо нее функционирует "хозяйская" мембрана, которой хозяин окружает бактерию). IM - внутренняя мембрана. B2, B3... - белки virB2, virB3 и т.д. (см. ниже).
Как видно из рисунка, белки virB2, virB3, virB5 образуют пилус, virB6-10 - канал, virB4, virB11 представляют собой внутренние мембранные АТФ-азы.
В геноме вольбахии гены vir собраны в два оперона (оперон - несколько генов, идущих в хромосоме подряд, и транскрибируемых вместе - получившаяся единая РНК потом режется на кусочки. Гены, входящие в один оперон, обычно тесно связаны друг с другом по своей функциональной роли). На рисунке показано строение vir-оперонов у вольбахии wMel, риккетсии (R.conorii) и агробактериума (A.tumefaciens).
(Рисунок из статьи Wu et al. (2004))
Видно сходство в строении оперонов T4SS у этих трех бактерий. Можно заметить, что у риккетсии и вольбахии - внутриклеточных бактерий - отсутствуют белки virB2 и virB5, образующие пилус. Очевидно, им не нужно вступать в контакт с наружной поверхностью клетки хозяина, поэтому и пилус им ни к чему. Белок virD4, имеющийся у всех трех видов, не имеет фиксированного положения в T4SS: он прикрепляется к транспортируемым макромолеклулам и каким-то образом помогает их транспортировке.
Белки вольбахии WD0856, WD0855, WD0854 очень похожи на virB6 и, вероятнее всего, участвуют в образовании основного канала T4SS. Белок WD0853 совершенно не похож на vir-белки, зато у него есть некоторое сходство с белками семейства SMC, которые способны связываться с хромосомами и регулируют митоз у эукариот. Это, таким образом, в высшей степени "подозрительный" белок (ведь вольбахия, как известно очень ловко умеет управлять митозом клеток хозяина). Белок WD0853, таким образом, заслуживает самого пристального внимания.
Имеющийся у внеклеточных патогенных бактерий белок VirB7 - липопротеин наружной мембраны, способный взаимодействовать сам с собой и с virB9, образуя дисульфидные связи. Гетеродимер VirB7VirB9 локализуется в наружной мембране и играет решающую роль в стабилизации остальных virB-белков в процессе сборки транспортировочной машины. Отсутствие белка virB7 у вольбахии и риккетсии согласуется с редукцией у них наружной мембраны, вместо которой функционирует мембрана хозяина, окружающая бактерию. Очевидно, что такое радикальное изменение строения наружного слоя клеточной стенки должно было сопровождаться соответствующими изменениями белков периферической части T4SS. Однако какие-то белки, аналогичные по функциям virB2, virB5, и особенно virB7 должны присутствовать у вольбахии, хотя бы для того, чтобы обеспечивать транспортировку макромолекул через хозяйскую мембрану. Какие же из белков вольбахии могут выполнять эту роль?
Крайне интересен тот факт, что в состав одного из T4SS-оперонов вольбахии входит белок wspB. Это явно указывает на тесную связь между секреторной системой типа 4 и wsp-белками. Связь может быть как структурной, так и функциональной. Добавим к этому еще упомянутое выше сходство последовательностей wsp с некоторыми бактериальными регуляторами транспорта макромолекул через клеточную оболочку. Кроме того, очевидно, что, поскольку и wsp-белки, и T4SS безусловно принимают самое активное участие в регуляции взаимоотношений вольбахии с хозяином, их деятельность, по идее, должна быть четко согласована. Возможно, белки wsp располагаются на наружной поверхности вольбахии в тесной ассоциации с "хозяйской" мембраной и наружными отверстиями каналов T4SS, на месте отсуствующих пилей.
Предполагаемая связь wsp c наружной мембраной, образуемой хозяином, наводит на мысль о возможной связи штаммоспецифичности wsp со специфическими свойствами мембран разных хозяев. Это предположение, однако, не соответствует наблюдаемым фактам. Во-первых, уровень сходства штаммов, определяемый по последовательностям генов wsp, мало коррелирует с таксономической близостью их хозяев. Известно много случаев, когда очень близкими штаммами заражены таксономически неродственные виды членистоногих (например, паразитические осы и те виды бабочек, в которых паразитируют их личинки). Во-вторых, проведено много успешных опытов по пересадке штаммов вольбахии от одного хозяина к другому, причем эффект, оказываемый на хозяина, определяется в большей степени штаммом, чем биологией хозяина. Следовательно, штаммоспецифичность wsp связана с чем-то другим.
Теперь попробуем собрать все в единую схему. Выше говорилось о:
1) возможной роли wsp в специфическом распознавании вольбахией "своих" меток на отцовских хромосомах после оплодотворения;
2) возможной непосредственной связи wsp с T4SS;
3) происхождении T4SS от конъюгационного аппарата.
Исходя из этого можно предположить, что специфическое распознавание, необходимое вольбахии для осуществления "цитоплазматической несовместимости", является производным (или, в более общем смысле - наследием) того механизма, который выработался у свободноживущих предков вольбахии для того, чтобы конъюгирующие особи могли отличать своих от чужих. Ведь обмен генами при конъюгации может происходить только между родственными бактериями (только в этом случае бактерия-реципиент приходит в т.н. "состояние компетентности" и принимает чужую ДНК). Конъюгационный аппарат, следовательно, должен содержать механизмы распознавания своих и чужих (какие-то специфические антигены и распознающие их рецепторы). wsp-белки могут быть производными или, по крайней мере, аналогами такого механизма.
Белки с анкириновыми повторами довольно редко встречаются у бактерий. Считается, что это типично эукариотические регуляторные белки, участвующие в разнообразных межбелковых взаимодействиях. Особенно важную роль они играют в регуляции деятельности цитоскелета. Возможно, бактерии получили эти белки от эукариот в результате латерального переноса (Bork, 1993).
Еще одной уникальной особенностью генома вольбахии оказалось наличие большого числа белков с анкириновыми повторами. У вольбахии штамма wMel таких белков 23 - намного больше, чем у любой другой бактерии. Что опять-таки удивительно, учитывая маленький размер генома вольбахии.
В статье Wu et al. (2004) указано, что по крайней мере некоторые из этих белков могут выводиться наружу через секреторную систему типа 4. Там же приводятся следующие факты, говорящие о том, что эти белки действительно могут регулировать клеточный цикл хозяина и/или взаимодействовать с его цитоскелетом:
1) Многие анкирин-содержащие белки эукариот присоединяют мембранные белки к цитоскелету;
2) Анкириновый белок бактерии Ehrlichia phagocitophyla связывает конденсированный хроматин хозяина и может быть связан с регуляцией клеточного цикла (Caturegli et al., 2000)
3) Некоторые белки, изменяющие активность белков-регуляторов клеточного цикла у D.melanogaster, содержат анкириновые повторы (Elfring et al., 1997)
4) Штамм вольбахии из осы Nasonia vitripennis вызывает цитоплазматическую несовместимость, возможно, воздействуя на те же самые белки-регуляторы клеточного цикла (Tram, Sullivan, 2002).
Некоторые из анкириновых белков вольбахии проявляют заметное сходство с различными регуляторными белками эукариот (включая D.melanogaster), способными связываться с важнейшими компонентами эукариотического цитоскелета - актином, миозином, кортактином. Есть сходство и с анкириновыми белками, регулирующими процесс апоптоза (программируемой клеточной смерти) (Shohat et al., 2002).
О том, что вольбахия способна взаимодействовать с цитоскелетом и влиять на его функционирование, говорят многие факты: ассоциированность вольбахий с микротрубочками и полюсами митотических веретен в яйце и эмбрионе у насекомых; вызываемые вольбахией нарушения митоза, в том числе изменения в движениях хромосом, в поведении отцовской центриоли в оплодотворенном яйце и т.д. Вспомним также, что по крайней мере в одном случае экспериментально подтверждено введение в клетки хозяина бактериями (Helicobacter pylori) через T4SS белков - регуляторов цитосколета.
По-видимому, белки с анкириновыми повторами – наиболее вероятные кандидаты на роль главных регуляторов воздействия вольбахии на размножение и развитие хозяина. Уникально высокое разнообразие эффектов, оказываемых вольбахией на хозяев, можно сопоставить с уникально большим числом анкириновых белков, имеющихся у этой бактерии.
Продолжение следует