Проблемы Эволюции

Михаил ГОЛУБОВСКИЙ (генетик, академик РАЕН)

Стоит ли варить суп из топора?

Я

всегда с интересом читаю в «Вестнике» биомедицинские эссе проф. Даниила Голубева. Они привлекают сочетанием профессионализма с ясностью и эмоциональностью изложения. С интересом прочитал и новую заметку «Страсти по клонированию» с подзаголовком «Как Америка теряет лидирующее положение в медицинской науке».

Однако на сей раз, испытывая неизменное уважение к автору и сознавая важность проблемы, я почувствовал необходимость, как говорили в старину, взяться за перо и оспорить ряд содержащихся в заметке утверждений. Хотелось бы заодно показать, как скошенные оценки и недостаточно обоснованные упования или опыты в области генной и эмбриологической инженерии искаженно транслируются в общество как некие магические средства, способные дать чудодейственный результат при их немедленном внедрении.

Несомненно, Даниил Голубев прав, что изучение и возможное терапевтическое применение стволовых клеток — важная общебиологическая и медицинская проблема. Это важный путь к пониманию клеточных и молекулярных основ развития. Даже первый вопрос — с чего начинается жизнь и развитие, не так-то прост. Напомню, каждый из нас в сей бренной жизни возникает из одной «ничтожной» яйцеклетки. После встречи со спермием и объединением их геномов яйцеклетка повышает свой ранг, превращается из женской половой клетки (гаметы) в зиготу, немедленно приступает к делениям и в их ходе дает начало новому организму. Яйцеклетка, пожалуй, — самая высокоорганизованная человеческая клетка. Она ведь едина в трех ипостасях — и гамета, и зигота, и живой микрокосм, управляющий самыми первыми и сложными этапами развития эмбриона. Я убедился, как мало даже среди биологов полного осознания того удивительного «медицинского факта», что одна определенная яйцеклетка не только генетически (набор генов), но и физически, материально, как отдельная клетка, связывает воедино три поколения. Ведь, (и это надо прочувствовать!) та или иная яйцеклетка, из которой возникает каждый из нас, обособляется как будущая женская гамета уже в утробе у бабушки, когда наша мама была там еще двухмесячным комочком. Затем эта самая пред-яйцеклетка два-три десятилетия дозревает уже в организме (яичниках) нашей будущей матери. Там, наконец, и происходит ее судьбоносная встреча со спермием. Из этого жизненного сценария в три поколения следует неожиданный вывод, что условия, в которых проходил ранний период беременности у бабушек, способны через уже предуготованные яйцеклетки внучатого потомства влиять на его генофонд и качество!

С этих позиций чуть легче ответить на вопрос, который мучил Пушкина, когда ему исполнилось 28 лет: «Кто меня враждебной властью / Из ничтожества воззвал, / Душу мне наполнил страстью, / Ум сомненьем взволновал?..»

Запомним: душе — страсти, а уму — сомнения.

Зрелая яйцеклетка млекопитающих способна приступить к развитию и без помощи спермия, проникающего (один среди сотен тысяч или миллионов претендентов) в ее просторное лоно-цитоплазму. Такого рода спонтанное развитие по типу непорочного зачатия называется партеногенез. Он хорошо известен в природе в норме у ряда видов живых существ (пчелы, лягушки, ящерицы и даже змеи). Найдены вещества, влияющие на обмен ионов кальция и способные при обработке ими зрелых яйцеклеток обезьян и человека с высокой частотой запускать, без всякого спермия, ранние эмбриональные деления вплоть до стадии бластоцисты. Так, в опубликованном в 2002 году исследовании сообщается, что у около 14% яйцеклеток, взятых у самок обезьян-макак, удалось искусственно вызвать партеногенез вплоть до стадии бластоцисты. При этом у одной из них были впервые выделены партеногенетические стволовые клетки (Science. 2002.295:819). Правда, к огорчению прекрасных дам, предпочитающих лесбийскую любовь и однополые браки, уже регистрируемые в Калифорнии, придется заметить, что даже у макак непорочные яйцеклетки не развиваются далее стадии бластоцисты. Природой здесь наложен запрет, и без мужского вмешательства, к счастью, не обойтись.

По мере делений яйцеклетки возникает около 200 морфологически и функционально различных типов клеток, из которых слагаются все взрослые ткани и органы. Как это происходит — остается загадкой и ныне. Общая концепция развития, основанная на молекулярном уровне действия генов, только начинает складываться. Среди некоторых важных новых подходов — получение и исследование эмбриональных стволовых клеток, о чем пишет Даниил Голубев. Появляясь на стадии 5-дневного зародыша, эти клетки — непрерывно делясь и не дифференцируясь, оставаясь сами собой — обладают свойством в то же время порождать дочерние клетки самых разных типов — костные, мышечные, нервные. Это их удивительное свойство так и называют — плюрипотентность или мультипотентность, то есть плюрализм или множественность потенций развития.

Даниил Голубев рассказывает только о работе, где стволовые клетки удалось выделить из одной полученной клональной бластоцисты человека. К большому сожалению, у неискушенного читателя может создаться впечатление, что работа корейских авторов и есть новое слово в биологии и медицине. Вовсе нет! Эмбриональные стволовые клетки давно известны и изучаются у млекопитающих десятилетия. Получение же из клонов эмбриональных стволовых клеток давно налажено на разных животных моделях.

Подлинный прорыв в данной области в последнее десятилетие связан с изучением не эмбриональных, а с открытием взрослых стволовых клеток взрослого организма, о чем в данной заметке Голубева — ни слова! Между тем, многие наблюдения и эксперименты в области эмбриогенетики последнего десятилетия привели к новому концептуальному осознанию-открытию, что у человека каждый орган, каждый тип ткани взрослого организма среди массы своих клеток скрывает невзрачные стволовые клетки. До этого твердо полагали, что стволовые клетки у взрослых есть лишь среди клеток костного мозга, что обеспечивает непрерывное кроветворение. Оказалось, однако, что взрослые стволовые клетки находятся и в других тканях и органах. Они способны активироваться и принимать активное участие в восстановительных процессах при повреждениях. Так что можно внести коррективы во фразу-предупреждение по технике безопасности, которую можно встретить на американских заводах: «Помните, что Бог, создавая человека, не создал для него запасных частей!» Это так, но Создатель оставил надежду в виде драгоценной примеси стволовых клеток.

Открытие взрослых стволовых клеток серьезно меняет наши представления об организации тканей и органов, путях их восстановления при повреждениях или воспалительных процессах.

Отвлекаясь на миг в область истории биологии развития, замечу, что впервые стволовые клетки у взрослого организма обнаружил и изучил еще в 70-е годы российский гистолог Александр Фриденштейн (см. историю проблемы (1)). Это были так называемые «стромальные клетки костного мозга», которые в отличие от находящихся там же известных кроветворных стволовых клеток оказались более универсальными или мультипотентными. Вместе с кровотоком они способны устремляться к очагам повреждения в разных участках тела и под влиянием локальных сигнальных веществ дифференцироваться в нужные органу региональные функциональные клетки. В экспериментах на животных установлено, что введение этих клеток в зону повреждения сердечной мышцы снимает сердечную недостаточность. Так, по данным Американского кардиологического общества за 2000 год, у крыс с искусственно вызванным инфарктом в 90% случае добавленные клетки стромы костного мозга трансформировались в заново возникшие клетки сердечной мышцы. Подобная эмбриологическая инженерия на основе собственных стромальных клеток ныне используется в ортопедии. Здесь для запуска перехода подсаженных клеток стромы в клетки костной ткани (остеобласты) добавляют специальные сигнальные белки. В клинике применяют особые пористые губки или пластинки, наполненные одновременно стромальными клетками и индуцирующими сигнальными веществами, которые направляют развитие стволовых клеток по нужному пути создания «запчастей».

Эти и другие интересные факты о стволовых клетках взрослого организма собраны в недавнем обзоре ведущего российского эмбриолога и нейрогенетика академика Л.И.Корочкина (www.neurogene.ru/2003a4.htm). Очень ценно его признание: «В 70-е годы мною были описаны эмбриональные клетки в печени взрослой мыши (в книге «Взаимодействие генов в развитии». М. Наука. 1977). Однако, опираясь на существовавшие тогда взгляды, я не предполагал, что они обладают столь высоким потенциалом к развитию и принимают активное участие в репаративном процессе». Из этого ценного свидетельства (и других не столь частых в научных статьях признаниях) видно, что не всегда то, что видится глазом, осознается. И даже выдающимся ученым на извилистом пути к истине поневоле приходится быть в ситуации крыловского петуха, который, «навозну кучу разрывая нашел жемчужное зерно и говорит, зачем оно?..»

Л.И. Корочкин отмечает, что особое удивление биологов вызвало наличие стволовых клеток в центральной нервной системе, ибо высокоспециализированные нервные клетки полностью утрачивают способность к размножению. Отрадно подчеркнуть, что среди первооткрывателей стволовых клеток мозга у человека и исследователей их свойств — биологи из Петербурга, профессора Валерий Кукеков и Татьяна Игнатова, ныне работающие в Институте мозга Университета Флориды (Gainsville). Два месяца назад я посетил их лабораторию. В.Кукеков рассказал мне о генезисе своего замечательного открытия (фактически он был первым среди первооткрывателей) и показал, как выглядят под микроскопом полученные им из одиночных стволовых клеток мозга клональные пересеваемые нейросферы и производные от них разные типы нервных клеток. Стволовые нервные клетки со сходными свойствами были выделены из разных участков мозга (2, 3). В 1998 году Кукеков выделил стволовые клетки из мозга 70-летнего человека! Ныне он довел методику до 100% вероятия выделения нервных стволовых клеток из любой зоны мозга, если они там есть в концентрации хотя бы 1:1000. Обычные клетки при росте в культуре липнут друг к другу и не способны расти без контактов. Стволовые же клетки — это гордые одиночки, они не нуждаются в контактах. Стволовые клетки также необычайно устойчивы к разным стрессовым условиям среды, включая ионизирующее облучение. Невероятно, но Кукекову удалось выделять стволовые клетки мозга спустя несколько дней (до 7) после клинической смерти человека!

В 2002 г. Кукеков и Игнатова установили, что среди конгломерата клеток самых разных опухолей мозга можно выделить клетки очень сходные по своим свойствам со стволовыми (neural stem-like cells). Это привело к неожиданной заманчивой гипотезе: а не связано ли возникновение раковой опухоли с тем, что дремлющие до поры до времени в каждом органе стволовые клетки способны видоизменяться и в серии своих трансформаций порождать опухоли? Тогда многое предстает в другом ракурсе (4). В пользу этой гипотезы говорит и то, что эмбриональные стволовые клетки, подсаженные в разные органы, ведут иногда к возникновению опухолей…

Как видно, исследовательский ландшафт в области изучения стволовых клеток очень разнообразен и главные пики здесь — это работы в области взрослых стволовых клеток человека и эмбриоинженерия на модельных животных объектах. Поэтому фантастическим преувеличением звучит, на мой взгляд, утверждение Даниила Голубева, что изучение именно эмбриональных стволовых клеток человека, полученных, как в работе корейских авторов, методом клонирования «является главной надеждой мировой медицины» и что морально-этические сомнения о такого рода опытах на человеке подобны обезьяньим процессам. Да ничего подобного! Пожалуйста, получайте вдоволь стволовые клетки из эмбрионов макак или собак и изучайте, что хотите. А рекрутировать 20 девушек или женщин, под видом волонтерок помещать их в клинику, применять к каждой из них дорогостоящее и не совсем безобидное гормональное воздействие, дабы вызвать суперовуляцию (кстати, при этом возникает около 1% осложнений), затем переносить в полученные яйцеклетки ядра соматических клеток и индуцировать деления вплоть до стадии бластоцисты, затем разрушать эти зародыши жизни, чтобы получить, наконец, одну линию эмбриональных клеток человека — в этом «терапевтическом клонировании» мне видится нечто из области мефистофельских деяний в их современном научном воплощении.

В связи с открытием взрослых стволовых клеток, а также успешным выделением стволовых клеток из пуповины и плаценты, Л.И.Корочкин делает совершенно справедливый вывод, что «отпадает необходимость так называемого терапевтического клонирования, с этической точки зрения весьма сомнительного (выделено мной — М.Г.). Кроме того, появились многочисленные работы, в которых показано, что в трансплантированных ядрах соматических клеток функции не менее 4% генов существенно нарушены…, не удается добиться полного репрограммирования ядер соматических клеток при помещении их в другую цитоплазму» (1).

Я совершенно не могу понять панического вывода, который вынесен в подзаголовок статьи Голубева, что «Америка теряет лидирующее положение в медицинской науке». Во-первых, в медицине много областей ну совершенно никакого отношения к стволовым клеткам не имеющих. Далее, а зачем уподоблять науку какой-то просоветской гонке — быть первыми в мире всегда и во веки веков? Вот открыли вирус ВИЧ (СПИДа) в институте Пастера в Париже — и прекрасно. Но даже если и принять этот тезис о безусловном лидирующем положении США, то, может быть, пусть она как самая мощная в мире страна будет всегда лидировать в области принятия самых взвешенных и продуманных решений. Вспомним, что говорил Нильс Бор — хорошо жить в малой стране, это избавляет от больших глупостей. Посему большей стране, дабы не впасть в большие глупости, нужны не эмоции и страсти, а умы, взволнованные сомнениями, и согласие сообщества.

В этом смысле отрадно, что после столкновения разных точек зрения президент Буш 9 августа 2003 года принял вполне взвешенное и благоразумное решение, которое хорошо известно проф. Голубеву. Оно таково. 1. Разрешить использовать для исследований уже имеющиеся около 60 линий эмбриональных стволовых клеток (по своему опыту генетика уверен, что этого хватит на многие десятилетия исследований). 2. Остановить пока федеральное финансирование работ по получению новых линий стволовых эмбриональных клеток методом создания и разрушения эмбрионов — терапевтическое клонирование. 3. Одобрить финансирование исследований по получению и использованию стволовых клеток взрослого человека. И, наконец, 4. — Для развития медицинских исследований в области стволовых клеток выделить дополнительно 250 млн. долларов. Чего же боле? Если такие решения будут приниматься всегда, то за судьбу медицинской науки в США нечего беспокоиться.

Д.Голубев совершенно правильно акцентирует различия между репродуктивным и «терапевтическим» клонированием у человека. Присоединяюсь к его выводам, что «все до сих пор имеющиеся сообщения о якобы удачных опытах получения клонированных младенцев не подтверждены и не достоверны», репродуктивное клонирование «в настоящее время неприемлемо и его запрещение оправдано».

Что касается терапевтического клонирования — то автор выступает, как я постарался показать, его неумеренным адептом. Здесь убеждения чувств временно затмили сомнения разума. Так, подробно излагая публикацию о впервые полученной в Южной Корее клональной линии эмбриональных стволовых клеток у человека, он восклицает: «Как же этим данным не радоваться?». По-моему, можно и нужно относиться к этой работе вполне спокойно, зная, что на макаках и тем более на мышах были получены гораздо впечатляющие в научном смысле результаты в области эмбриогенетики и эмбриональной инженерии.

К моему огорчению, избыток энтузиазма при популярном изложении работы корейских эмбриологов привел в заметке проф. Голубева к недопустимым упрощениям, которые, увы, стали почти правилом в транслировании в общество вполне рядовых успехов молекулярной и эмбриональной генетики. Эти упрощения становятся порой хуже известного порока и таят ряд опасностей, о которых неустанно напоминал умерший два года назад корифей молекулярной биологии Э. Чаргафф. Мне уже приходилось об этом писать в статье «Соблазны детерминизма» (Вестник, 13 марта 2001).

Вот пример. Излагая опыты корейских биологов, Голубев пишет, что в безъядерные яйцеклетки «вносится ДНК некоего конкретного существа». И затем такая яйцеклетка, мол, начинает делиться и дает нужный клон со стволовыми клетками. Ничего подобного! В безъядерную яйцеклетку во всех исключительно опытах по эмбриоинженерии вводится не выделенная биохимически ДНК, а живое ядро из соматической клетки — с самыми тщательными предосторожностями, с подгонкой стадии клеточного цикла, чтобы как можно меньше повредить живое ядро! Я убежден, что проф. Голубев прекрасно знает, что при клонировании в живую яйцеклетку, из которой деликатно убрано собственное ядро, осторожнейшим же образом вносится не мертвая ДНК, а живое ядро соматической клетки. Зачем у неискушенного читателя создавать искаженное впечатление, что, мол, внесли «чужеродную ДНК» — и нет проблем. Ведь вероятность получить что-либо путное лишь введением голых молекул ДНК примерно такова, как упования обезьяны быстрее попасть на луну, залезши на дерево. ДНК — необходимый, но вовсе не достаточный элемент сложной ядерно-клеточной системы. Метафору об обезьяне применил в свое время основатель первой кафедры генетики в России петербургский биолог Ю.А.Филипченко при критике упрощенных описаний эволюции.

В комментарии журнала Science, предваряющем публикацию исследователей из Южной Кореи (есть среди соавторов и американцы), ясно говорится, что нужная линия была создана «by inserting the nucleus», то есть путем введения ядра, взятого из одной из клеток, окружающих яйцеклетку. Да и в первой фразе оригинальной публикации исследователи называют свой метод как Somatic Cell Nucleus Transfer (SCNT) — то есть как перенос ядра из соматической клетки. Приравнивать же при обсуждении проблем эмбриологии и развития клеточное ЯДРО лишь к его ДНК это, употребляя выражение автора, «лихое обобщение». Оно вводит читателя в полное заблуждение, допуская прямо-таки карикатурную возможность: «Что мешает, к примеру, взять каплю крови или кусочек кожи президента Рейгана, выделить из них ДНК, ввести эту ДНК в денуклеированные яйеклетки женщины-волонтера (как это делали в Сеуле), а полученную затем линию стволовых клеток ввести в участок мозга Рейгана…». Да, повторюсь, пожалуй, обезьяна быстрее доберется до Луны, нежели по предлагаемой методике будут получены стволовые клетки Рейгана или другого почтенного деятеля.

И тут у меня возникает сомнение — а что, если здесь не невольное упрощение, а недостаточное представление всей генетической и эпигенетической сложности ядерно-клеточных взаимоотношений в ходе развития (здесь и эпигенетическое программирование и репрограммирование отцовских и материнских геномов, и стирание родительского «запечатления» или импринтинга хромосом и генов, и архитектоника хромосом в ядре, и иерархическая организация генных сетей и многие другие премудрости, которые здесь можно только назвать). При становлении каждого нового типа клеток варьирует не ДНК-овая структура генов, а уровень и спектр их активности, игры в составе генных концертных ансамблей. Из-за насильственного нарушения или неведения имманентных для эмбриогенеза сложностей и происходит гибель большинства экспериментальных зародышей. И именно это вызывает озабоченность многих специалистов и людей, не утративших здравого смысла. Тут меня опять охватывает сомнение или подозрение. А вдруг почтенный автор и на самом деле полагает, что одной голой ДНК для всего достаточно?

Теперь коснемся того, что связано с биоэтикой и философией эмбриональной инженерии. Эти проблемы регулярно обсуждаются в более двадцати специальных журналах, на эту тему выпущено около двух десятков книг. И опять-таки, уважаемый автор заметки с непростительной, на мой взгляд, простотой одним махом разделывается с очевидными биоэтическими и мировоззренческими ориентирами, которые и составляют суть цивилизованного общества: «не будем вступать в теологические споры о том, с какого момента начинается жизнь — с проникновения сперматозоида в яйцеклетку или с момента формирования жизнеспособного эмбриона…». Но позвольте, во-первых, эти споры актуальны и возникают на уровне самой биологии, далее, на уровне биоэтики и, наконец, — юриспруденции, а не только теологии. А во-вторых, отчего же не сделать усилие и не подняться до уровня теологии и не задуматься о глубинных мировоззренческих основах несогласий и споров?

Приведу пример, когда даже гораздо более простая ситуация, связанная с искусственным (внетелесным) оплодотворением потребовала вмешательства суда. Несколько лет назад, когда я работал в Австралии, там в газетах обсуждался такой случай. У молодой пары долго не было детей (увы, нарушение фертильности свойственно около 10% пар). Эта семья прибегла к искусственному оплодотворениию (IVF — In vitro fertilization), и родился чудесный ребенок. Но спустя несколько лет супруги развелись. Затем жена захотела иметь второго чудного ребенка по той же процедуре, благо в клинике сохранились замороженные спермии бывшего мужа. Спросили на всякий случай его согласия. А он ни в какую, говорит, это мои половые клетки, эта часть моего мужского человеческого достояния. Помилуйте, восклицает бывшая жена, да эти замороженные спермии никакого отношения к вашему человеческому достоинству не имеют. Кроме того, они были помещены в холодильник, еще когда мы состояли в браке. В спор включились эмбриологи, врачи, юристы. И всё-таки суд принял сторону мужа, посчитав, что у гаметы есть неразрывный (хотя и телесно отторжимый) элемент человеческого существа, и на них тоже распространяются его (мужа) права.

В контексте возникающих споров Даниил Голубев четко излагает свою позицию: «Я никак не могу принять тезиса о нетленных «правах» пятидневной бластоцисты и лишения на этой основе права ученых заниматься своим делом, а больных — надеяться на помощь». Но ведь никто в США не лишает ученых права «заниматься своим делом». Пожалуйста, сколько хотите, может парировать государственный муж. Только делайте это за свой собственный счет или открывайте фирму. Но коль скоро вы просите федерального финансирования, апеллируете к Конгрессу и широкой аудитории, то будьте любезны обсуждать это на ответственном профессиональном уровне и с полным вниманием к доводам и позиции всех оппонентов, включая теологов и просто людей здравого смысла, так сказать, обывателей и обитателей страны.

Один вопрос автор все-таки задает своим потенциальным оппонентам, сторонникам запрета в настоящее время (а будущего мы не знаем) экспериментов в области терапевтического клонирования человека. Если, мол, не допускать разрушать эмбрионы на стадии бластоцисты, то «как же с таким трепетным отношением к жизни можно примирить практику производства абортов, которые в США не запрещены и широко применяются». Вопрос справедливый. И на него трудно ответить, следуя лишь строгой логике, как и на многие другие существующие в обществе социальные установления, традиции, порядки. Правда, автор сам частично отвечает, говоря о правах женщин. Полагаю, что принятие индивидуального решения об аборте воспринимается все же большинством женщин как трудный, мучительный и вынужденный шаг. Хотя новая жизнь возникает как бы невольно, помимо осознанного желания или воли двух лиц. Большинство религий говорят об участии в этом созидательном акте и третьей высшей силы, и потому относятся и к абортам, и к сознательному разрушению эмбрионов в целях науки как к вызову и противостоянию высшему замыслу. Наука здесь переходит свои пределы.

Наконец, последний постоянный довод, на который не устают ссылаться неумеренные генные инженеры и сторонники немедленного внедрения всех новых манипуляций с половыми клетками и зародышами — это страждущие больные, которым якобы эти методы способны принести исцеление. Когда, при каких условиях — вот о чем следует задуматься. Здесь ведь неявно проскакивают через несколько этажей незнания, словно ученый кот из детской байки, который хвастался, что через семь классов вмиг прошел. Ведь полученные с такими усилиями при терапевтическом клонировании клональные половые клетки никому кроме их обладателя помочь не могут в силу их иммунного отторжения. Кроме того, способ трансплантации ядер неизбежно приводит к генетическим и эпигенетическим мутациям в потомстве клонов, и потому неизвестно, как они будут себя вести после введения в больную ткань. Остается лишь надеяться, как пишет сам Голубев, что взвесь таких клеток «теоретически может «превратиться» в нормальные элементы этой ткани». А если нет, и эта взвесь трансформируется в раковую опухоль или вместо нервных клеток возникнут мышечные? Пройдут десятилетия, прежде чем терапия на базе стволовых клеток осмысленно и безопасно войдет в клинику. Лукавый солдат из сказки Андерсена уверял доверчивую старуху, что может сварить суп из одного топора. А потом оказалось, что нужно немного соли, немного мяса, немного специй. Так стоит ли следовать методике варки супа из топора?

Литература.

1. Корочкин Л.И. Стволовые клетки как общебиологическая проблема. 2004. Бюлл. эксперим. биол. медиц. Сайт www.neurogene.ru

2. Kukekov et al. Multipotent stem/progenitor cells with similar properties arise from two neurogenic regions of adult human brain.1999. Exp.Neurol.156 (2):233-244.

3. Suslov O.N., Kukekov V.G., Ignatova T.N., Steindler D.A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurosperes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. 99:14506-14511.

4. Ignatova T.N., Kukekov V.G et al. Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitro. Glia. 2002. 39(3):193-206.